Fluorescenční derivát pro nekatalytické značení složek nukleových kyselin a peptidů

Nekatalytické značení biomolekul je v současnosti intenzivně studováno v souvislosti se sledováním jejich lokalizace, interakcí s jinými biomolekulami nebo ligandy či např. sledováním jejich biosyntézy při zásazích do buněčného systému. K nekatalytickému značení se často používají deriváty na bázi cyklooktynu, které velmi rychle reagují s azidosloučeninami při laboratorní teplotě. Jejich nevýhodou je však složitá vícekroková syntéza a nízká komerční dostupnost. Jako alternativa se proto používají aza-dibenzocyklooktynové (dibenzoazocinové) systémy nesoucí fluorescenční značku. Dosud byly tyto systémy popsány pouze jako konjugáty s fluoresceinem, rhodaminem a kumarinem. Vývoj nových dibenzoazocinových konjugátů je proto pro aplikace v oblasti značení stále velmi důležitý a perspektivní.

Kromě hodnot excitačních a emisních maxim, rozpustnosti ve vodě a kvantového výtěžku fluorescenční značky je pro její praktické využití důležitá také fotostabilita samotného indikátoru i jeho konjugátů a minimální vliv indikátoru při fragmentační analýze biomolekul. Z tohoto hlediska vynikají značky na bázi BODIPY, neboť vykazují lepší fotostabilitu než fluorescein a mají minimální vliv na mobilitu fragmentů při sekvenování DNA. Vyvinuli jsme konjugát BODIPY s dibenzazocinovou molekulou, který se dokáže spontánně vázat na proteiny nebo nukleové kyseliny nesoucí azidovou skupinu a tvořit kovalentně značené molekuly. Navržený systém lze následně využít ke sledování proteosyntézy nebo syntézy oligonukleotidů jako klíčových faktorů správné funkce buněk, enzymů či procesů, jako je proliferace a apoptóza. Tímto způsobem lze indikovat různé patologické změny. Uvedený systém proto může sloužit k diagnostice závažných onemocnění, jako jsou nádorová onemocnění.

Hlavními nevýhodami již popsaných systémů jsou dostupnost, složitá syntéza nebo chemická stabilita. Některé z nich navíc vyžadují pro značení vysokou teplotu, která může vést k poškození molekulární struktury. Námi vyvinutý systém naproti tomu umožňuje navázat fluorescenční značku typu BODIPY na proteiny, nukleové kyseliny a jejich složky. Samotné značení probíhá bez katalyzátoru v různých rozpouštědlech, při laboratorní teplotě a s dostatečnou intenzitou fluorescence i při nízkých koncentracích.

CZ 30136