Metoda stanovení aktivity enzymů přeměňujících deriváty cytosinu na deriváty uracilu v buňkách, tkáních a organismech

Analogy nukleosidů jsou široce používaná léčiva v chemoterapii nádorových a virových onemocnění. Jejich použití a účinnost výrazně ovlivňuje celá řada mechanismů zahrnujících transport, fosforylaci, katabolismus a také vzájemnou kompetici s přirozenými nukleosidy. Na deaminaci analogů deoxycytidinu a jejich monofosfátů na deriváty uracilu se podílejí enzymy specifické pro cytosin. Významným příkladem takových analogů jsou některá léčiva, např. ara-C (1-β-arabinofuranosylcytosin), dFdC (2’,2’-difluor-2’-deoxyuridin), PSI-6130 (β-D-2’-deoxy-2’-C-methylcytidin), L-dC (β-L-2’-deoxycytidin) nebo 5-aza-dC (5-aza-2’-deoxycytidin). Lze proto očekávat, že jejich deaminace může ovlivnit výsledky léčby. V současnosti však chybějí rychlé a spolehlivé postupy stanovení aktivity cytosindeamináz. Nejběžnějším přístupem ke stanovení aktivity cytosindeamináz v buňkách je analýza produktů deaminace po rozrušení buněk nebo tkání. Se současnými technikami jde však o poměrně zdlouhavý proces, často s použitím radioaktivních značek a speciálního vybavení, který umožňuje získat údaje o průměrné aktivitě v relativně velké populaci buněk, nikoli však v malých buněčných populacích či v jednotlivých buňkách.

Vyvinutá metoda umožňuje rychlé stanovení aktivity enzymů přeměňujících deriváty cytosinu na deriváty uracilu ve vzorku tkání nebo buněk s využitím analogů cytosinových nukleosidů. Tyto látky se deaminací přeměňují na deriváty uracilu, které se následně detekují v DNA nebo RNA. Poté se stanoví množství analogu uracilového nukleosidu a signál lze analyzovat např. klasickými mikroskopickými technikami, průtokovou cytometrií nebo pomocí readerů mikrodestiček.

►Provedení protokolu trvá méně než 5 hodin včetně 4hodinové inkubace se substrátem ►Jednoduché provedení experimentu
►Signál lze detekovat třemi různými metodami: fluorescenční mikroskopií, pomocí readerů mikrodestiček a průtokovou cytometrií
►Není nutný další vývoj

PV 2014-579 PCT/CZ2015/000097 EP 3186387

Výhradní/nevýhradní licence k patentům, souvisejícímu know-how a datům